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本文標題:"大腸桿菌中表達和純化蛋白質載體的特征技術"

發布者:yiyi ------ 分類: 行業動態 ------ 人瀏覽過-----時間:2017-2-26 0:37:10

大腸桿菌中表達和純化蛋白質載體的特征技術

 
在原核生物特別是大腸桿菌中表達真核生物的目的基因。純化出的
蛋白質表達產物是研究蛋白質結構與功能,蛋白質一蛋白質、蛋白
質一核酸間的相互作用,制備抗體及突變研究等的基礎,也是基因
克隆的目的所在。在大腸桿菌中表達和純化蛋白質操作相對簡便,
表達效率很高,而且表達量容易控制,因此應用最為廣泛。目前蛋
白質表達的方法大多是將編碼所需產物的基因插入表達型質粒,然
后將該載體導人細胞。典型的表達載體除具有一般克隆載體的特征
外還包含指導相應mRNA大量合成的啟動子、允許其在宿主體內自主
復制的序列和能增強mRNA翻譯效率的序列。
    1)原核表達載體特點
    根據不同需要,人們構建了多種原核表達載體,即在相應的受
體細胞中能表達外源基因的載體,這些原核表達載體通常有如下特
點:①有一個強的原核啟動子及其兩側的調控序列;②應有SD序列
,而SD序列與起始密碼子AUG之間要有合適的距離;③在克隆基因
與啟動子之間應有正確的可讀框;④外源基因下游應加入不依賴p
因子的轉錄終止區。
    2)提高外源基因表達水平的措施
    只要考慮到表達載體、外源基因的性質、原核細胞的啟動子、
可讀框及宿主調控系統等條件,一般都可使外源基因在原核細胞中
有所表達。但如何使外源基因在原核細胞中獲得高效表達仍是需要
努力探索的目標之一?,F在可通過以下方法提高基因的表達水平:
①調整SD序列與AUG之間的距離;②用點突變的方法改變某些堿基
,以消除mRNA二級結構,提高翻譯的完整性;③在真核基因下游插
入重復性回文序列或其他具有反向重復序列的DNA片段,防止限制
性外切核酸酶的攻擊,從而起到穩定mR—NA,提高表達水平的作用
;④通過誘導表達或誘導復制,減輕細胞代謝負荷,提高外源基因
表達效率;⑤在外源蛋白N端加一段原核短肽或采用某種蛋白酶突
變菌株,保護表達蛋白不被降解。

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